ABI_Stepone 熒光定量PCR儀因操作方便、運行速度快、實(shí)驗結果準確，受到越來(lái)越多的分子生物學(xué)研究者青睞。在實(shí)驗技術(shù)成熟的今天，也許對你來(lái)說(shuō)，最難得不是實(shí)驗技術(shù)上的問(wèn)題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢(xún)實(shí)驗室成員的意見(jiàn)、分析實(shí)驗室目前乃至將來(lái)的需求、平衡實(shí)驗室的預算，更要詳細研究各種極富吸引力的宣傳資料。面對各種不同性能的產(chǎn)品，您又該如何選擇呢？
建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個(gè)誤區：
誤區一：儀器通道越多越好
隨著(zhù)PCR技術(shù)的成熟運用，多重擴增越來(lái)越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從最初推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個(gè)廠(chǎng)家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無(wú)所適從，就有人一不小心走進(jìn)了“通道越多越好”的誤區。
在使用有些廠(chǎng)家5通道的熒光定量?jì)x時(shí)，為了確保實(shí)驗結果的精確性和準確性都要在實(shí)驗中使用ROX（一種熒光染料）或專(zhuān)用的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個(gè)檢測通道。這樣以來(lái)，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì )增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠(chǎng)家的專(zhuān)用的熒光染料或試劑開(kāi)放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱(chēng)的那么多。在購買(mǎi)前確認ABI_Stepone 熒光定量PCR儀的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽(tīng)宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時(shí)候也應該從實(shí)驗室實(shí)際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實(shí)驗復雜化了。
誤區二：real-time PCR儀無(wú)需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì )很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬(wàn)化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問(wèn)題。梯度PCR的出現部分解決了一些問(wèn)題——在反應過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在特定范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以?xún)?yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來(lái)說(shuō)這個(gè)非常重要，因為T(mén)aq和校正酶的最佳反應溫度可能有顯著(zhù)差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的ABI_Stepone 熒光定量PCR儀可以一次完成以往多次實(shí)驗才能完成的優(yōu)化過(guò)程，簡(jiǎn)化了摸索 PCR反應條件的繁瑣實(shí)驗，既節省實(shí)驗時(shí)間提高效率，又節省實(shí)驗成本。
