1、內標對熒光定量PCR儀的影響

　　若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則 PCR 反應變?yōu)殡p重 PCR，雙重 PCR 反應 中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時(shí)，這種競爭會(huì )表現得更為顯著(zhù)。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無(wú)法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個(gè)原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。

　　2、熒光定量 PCR 無(wú)需內標定量

　　熒光定量PCR儀技術(shù)有效地解決了傳統定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現了每一輪循環(huán) 均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對每個(gè)樣品 Ct 值的計算，根據 標準曲線(xiàn)獲得定量結果。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 無(wú)需內標是建立在兩個(gè)基礎之上的：

　?。?）Ct 值的高度重現性 PCR 循環(huán)在到達 Ct 值所在的循環(huán)數時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數擴增期（對數期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此 Ct 值的重現性*，即同一模板不同時(shí)間擴增或同一時(shí)間不同管內擴增，得到的 Ct 值是恒定的。

　?。?）Ct 值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對數存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標準曲線(xiàn)對未知樣品進(jìn)行定量測定， 因此，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是一種采用外標準曲線(xiàn)定量的方法。

　　外標法定量和內標法定量的方法學(xué)比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線(xiàn)的定量方法是一種準確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。熒光定量PCR儀